Alexander Fleming 'in efsanevi penisilin keşfi, 1928'de, çıbanlara neden olan ve ayrıca zayıf bağışıklık sistemi olan hastalarda feci enfeksiyonlara neden olabilen yaygın bir bakteri türü olan stafilokları araştırırken gerçekleşti. Alexander Fleming iki haftalık bir tatil için ayrılmadan önce, stafilokok kültürü içeren bir petri kabı laboratuvar tezgahına bırakıldı ve asla amaçlandığı gibi inkübatöre yerleştirilmedi. Her nasılsa, hazırlarken bir Penicilliumküf kazara ortama bulaştı. Belki bir pencereden giriyordu ya da daha büyük olasılıkla çeşitli küflerin olduğu aşağıdaki laboratuvardan bir merdiven boşluğunda süzülmüştü.

Alexander Fleming 'in laboratuvar defterleri kabataslaktır ve keşifle ilgili sonraki açıklamaları çelişkilidir. İlk fotoğrafını çektiği kanıtlar, lizozim çalışmalarında olduğu gibi bakterilerin lizizini, zayıflamasını ve yok edilmesini gözlemlediğini gösteriyordu. Ancak bazen, kilit gözlemi, küfü çevreleyen açık bir bölge tarafından kanıtlanan, küf "suyundan" etkilenen alanlarda bakteri üremesinin bir inhibisyonu veya önlenmesi örneği olarak tanımladı. Bu iki etki oldukça farklı koşullar altında meydana gelmesine rağmen, Fleming muhtemelen hangi gözlemin önce geldiğini unutmuştu, çünkü orijinal gözlemi takip eden aylarda koşulları sistematik olarak değiştirirken birçok deney yaptı.

Alexander Fleming Antibakteriyel maddenin tüm küfler tarafından değil, yalnızca belirli Penicillium türleri, yani "Penicillium notatum" tarafından üretildiğini keşfetti. Onu izole edemese de etken maddeye penisilin adını verdi. Saf olmayan ürünü üretme yöntemlerini inceledi ve farklı sıcaklıklarda çeşitli sürelerde stabilitesini belirledi. Frengiye neden olan tanıdık spiroketi merakle göz ardı ederek birçok mikrop üzerindeki etkisini araştırdı. Toksisitesini bir laboratuvar faresi ve bir tavşan üzerinde test etti. Sonsuza dek, bu veya diğer laboratuvar hayvanlarına penisilin içeren sıvıyı enjekte etmeden önce stafilolok veya diğer hastalığa neden olan bakterileri enjekte edip etmediği bir bilmece olmuştur. Belki de açıklama, tedavilerin bir dış etkenden ziyade vücudun içinden geldiğine olan inancında yatmaktadır.